クローディン

タイトジャンクション

クローディン英語、Claudin)は、細胞間結合の様式の1種である、タイトジャンクション(密着結合)の形成に関わる主要なタンパク質である。タイトジャンクションにおけるストランド形成を担っており、細胞間バリアーを作り出している[1]2010年までにヒトで24種類のタイプが報告されている。

目次

構造編集

クローディンは分子量が20~27kDa(キロダルトン)の小さな膜タンパク質である。細胞膜を4回貫通しており、N末端C末端は細胞質側に局在(つまり、クローディンの一次構造の末端部分はいずれも細胞の内側に存在)し、2つの細胞外ループを持っている。1つ目の細胞外ループは、2つ目に比べて長い。また、N末端側は通常、4~10残基と非常に短いのが特徴である。C末端側の長さは21残基から63残基であり、クローディンが密着結合へ局在するのに基本的に必要である[2]。またクローディンの多くは膜裏打ちタンパク質PDZドメインと結合するためのドメインを有している。

機能と疾患編集

クローディンはタイトジャンクションにおける細胞間バリアーの中心的な働きをしており、生体のホメオスタシスの維持に必須のタンパク質である。また、ヒト で24種類ものメンバーを有しているが、臓器や組織ごとに発現パターンが異なっており、多様なバリエーションを持っている。例えば、クローディン-5のノックアウトマウスでは血液脳関門のバリアー機構が破綻をしている[3]。また、低マグネシウム血症というヒトの遺伝病は、クローディン-16の分子異常により病気を引き起こすという報告がある[4]

発見の経緯編集

クローディンは1998年に京都大学月田承一郎らのグループによって報告された[5]。クローディン発見前の1993年、月田らはタイトジャンクションの構築に必須なタンパク質と思われたオクルディン(occludin)を同定していた。しかしながら、オクルディンをノックアウトしてもタイトジャンクションが形成されたことから、他の必須タンパク質の存在が示唆された。そのため、月田らは、オクルディンの精製過程を見直し、試行錯誤の末、クローディンの発見に至った[6]。クローディンの名前はラテン語claudere(閉まるという意味)から名付けられた[7]

立体構造編集

1998年に月田、古瀬らがクローディンを発見して以来、その立体構造は不明であった。一次構造から模式図が作成されていたのみであった。2014年に大阪大学名古屋大学東京大学の共同研究グループが世界ではじめてクローディンの立体構造を報告した[8][9]。彼らはSf9 insect cellという昆虫培養細胞発現系を用いてクローディンの発現と精製を試みた。異なるサブタイプをいくつも試し、マウスのクローディン-15が発現量も多く、純度もよく精製することができた。良質な結晶作成のためクローディン機能として最も重要なTJストランド形成に最低限必要な領域のみ残したC末端欠損コンストラクトを作成し、脂質キュービック相法[10]を用いて結晶を作成した。兵庫県の大型放射光施設SPring-8でビームラインBL32XUを用いてX線回析データから2.4オングストローム分解能でクローディン-15の結晶構造が得られた。この結果により、クローディンは4回膜貫通型の新規の折りたたみ構造をとること、細胞外領域のβシート構造はクローディンに保存された基本構造であること、クローディンの重合にはECHとTM3-β5との間での保存された疎水的な相互作用が重要であること、クローディン単量体は細胞外に掌を向けたような構造をしていること、細胞外表面領域がTJストランド中のイオン透過経路を作ることが明らかになった。

クローディンは4回膜貫通型の新規の折りたたみ構造をとる

マウスのクローディン-15は幅約3nmの大きさの分子であり4回膜貫通型タンパク質である。一次構造ではN末端からTM1、ECS1、ECH、TM2、TM3、ECS2、TM4と配列している。結晶構造からマウスのクローディン-15は左巻きの4本ヘリックスバンドルからなる膜貫通領域(TM1-TM4)と2つの細胞外ループ部分が形成するβシート構造領域があることが明らかになった。膜貫通領域(TM1-TM4)にはグリシンやアラニンなどの小さな側鎖を多く含み、ヘリックス同士が固く巻き付いた構造をとっていた。膜貫通領域(TM1-TM4)の変位で難聴低マグネシウム血症などの遺伝子疾患が報告されており4本ヘリックスバンドル構造はクローディンの生理機能に重要と考えられた。

細胞外領域のβシート構造はクローディンに保存された基本構造である

細胞外βシート領域は5本のβストランド(β1-β5)からなり、細胞外第1ループ(ECS1)の一部がβ1-β4として細胞外第2ループ(ECS2)の一部がβ5として含まれており、ひと続きの逆平行βシート構造を形成していた。これまで、細胞外第1ループと細胞外第2ループはそれぞれ別個のループ構造をもつと考えられていたが、実際にはループ構造ではなく、連続した1つの構造ドメインとして合体しているのが明らかになった。このフォールディングに重要なのがECS1中に存在するW-LW-CCという共通モチーフ配列であり、これはすべてのクローディンで保存されている。モチーフ配列中の2つのシステイン残基(Cys52とCys62)は分子内でジスルフィド結合を形成しており、β3とβ4の2つのストランドをつなぐことでβシートを構造を安定化していると考えられる。また、他の保存されたW-LW配列(Trp29、Leu48、Trp49)はβシート領域の根元側から脂質膜界面に突き刺さるように並んで配置しており、ヘリックスバンドル上部の裂け目の間に埋まっていた。この状態はあたかも錨(W-LW側鎖)をおろして細胞膜上にβシート領域を固定しているように見えることから、モチーフ配列は疎水的アンカーとして細胞外領域の構造を安定化するのに寄与しているとわかった。

クローディンの重合にはECHとTM3-β5との間での保存された疎水的な相互作用が重要である

マウスのクローディン-15分子は脂質キュービック相結晶中において単量体が横一列に並んだ状態でパッキングしており、隣接する分子間での横方向の相互作用には脂質膜界面に存在する細胞外の特定領域が関与していた。また観察された相互作用部位におけるアミノ酸変異導入とTJストランドの電子顕微鏡観察から、タンデムに隣接するECH(TM2直前の細胞外ヘリックス)とTM3-β5との間での保存された残基同士の疎水的な相互作用がTJストランドの形成に重要であることが示された。したがって結晶中でみられるこの直線上の並びは実際の生体内でみられるTJストランド中のクローディン重合体構造の一部を再現していると考えられる。

クローディン単量体は細胞外に掌を向けたような構造をしている

構造解析の結果、マウスのクローディン-15単量体は細胞外第1ループ(ECS1)と細胞外第2ループ(ECS2)による形成される5つのβストランドによって細胞外に掌をむけたような構造をとっている。5つのβシート構造を掌の左手の5本の指に例えるとクローディンは隣り合う細胞間であたかも掌同士が合わさるようにTJの細胞間バリアやチャネルを形成すると予想される。

細胞外表面領域がTJストランド中のイオン透過経路を作る

マウスのクローディン-15はカチオン選択的なチャネル型TJを形成する。ECS1中の酸性残基(Asp55、Asp64)がその選択性に寄与している。これらの残基はβシート構造領域の端に偏って位置している。そのためマウスのクローディン-15は細胞外表面領域が負に荷電される。他のクローディンサブタイプにおいても、この細胞外表面電荷がそれぞれのイオン選択性に応じた静電ポテンシャルをもっていることがホモロジーモデルから示された。TJストランド中においてクローディンの形成する掌状の荷電領域が傍細胞経路を覆うように配置することで透過・制限するイオンの選択性に寄与していることが示唆される。

クローディンバインダー編集

CPEとはウェルシュ菌(クロストリジウム・パーフリンジェンス、C.perfringens)のエンテロトキシンである。CPEはアミノ酸319残基からなる分子量35317Da、等電点4.3の易熱性の1本鎖ポリペプチドである。Pore-forming toxin(孔形成毒素)として機能し、2つのドメインからなるいわゆるAB毒素(Active&Bindingの両ドメインを有する毒素)である。すなわち細胞表面への結合(C末側受容体結合ドメイン)と、その後の膜孔形成による細胞の形態変化(N末側細胞傷害ドメイン)に分かれている。CPEが結合する受容体はクローディンである。クローディン3,4,6,7,8,14には結合するがクローディン1,2,5,10には結合しない。CPEの毒性の発現のメカニズムは以下のようにわかっている。

標的細胞への結合

主にクローディンのECS2を中心に結合すると考えられている。

細胞膜上の多量体化

細胞膜上で多量体を形成する。

細胞膜への孔形成

細胞膜に孔を形成しCaイオンを流入させることで細胞死を招く。

CPEの構造は2011年にSPring-8でビームラインBL44XUを用いて結晶構造解析されている[11]。 C-CPEはCPEのアミノ酸位189~319残基からなるC末端断片である。クローディンと相互作用をして標的細胞へとりつくが、多量体形成をしない。その結果標的細胞死は起こらないがタイトジャンクションは消失する。そのためタイトジャンクションバインダーとして知られている。

C-CPEとクローディンとの複合体の構造解析編集

方法編集

名古屋大学大阪大学の共同研究チームはC-CPEとクローディンとの複合体の構造を明らかにすることでC-CPEとクローディンとの詳細な相互作用機構およびC-CPEによるTJストランドの崩壊機構を明らかにしようとした[12][13]。構造解析に適したクローディンサブタイプのスクリーニングを行った。緑色蛍光タンパク質であるEGFPを融合させたマウスのクローディン27種類をSf9 insect cell(昆虫細胞)で発現させてC-CPEとの結合を蛍光検出ゲルろ過クロマトグラフィー(FSEC)で評価した。網羅的に解析した結果、末梢神経系の髄鞘で主に働くクローディン-19がC-CPE結合能を持つということがはじめて明らかになった。さらにクローディン-19を安定的に発現するSF-7細胞(マウスの精巣のセルトリ細胞由来の上皮様細胞)にTJを形成させた後、C-CPEを加え、TJストランドの崩壊が起こるかどうかを確認した。その結果、クローディン-19からなるTJストランドがC-CPE添加によって崩壊するこということが蛍光顕微鏡観察および凍結割断レプリカ法による電子顕微鏡観察で確認できた。このクローディン-19は安定でもあったため複合体の構造解析に適しているサブタイプとして選別した。  このクローディン-19とC-CPEをそれぞれ、昆虫細胞発現系、大腸菌発現系によって大量発現・精製し、それらを混合することによって、C-CPE/クローディン-19複合体を形成させた。蒸気拡散法で結晶化を試みた。このときクローディン-19のC末端は欠損させた。兵庫県の大型放射光施設SPring-8でビームラインBL32XUを用いてX線回析データから3.7オングストローム分解能でC-CPE/クローディン-19複合体の結晶構造が得られた。

結合様式編集

得られた複合体の結晶構造においてC-CPEはクローディン-19の細胞外領域と相互作用して結合していた。複合体中のクローディン-19の構造をC-CPE非感受性のクローディン-15の構造と比較したところ、基本的にはほぼ同じ構造をとっていた。しかしC-CPEが結合したクローディン-19では、細胞外領域のひと続きのβシート構造が2つに分割されたようになった。掌モデルで考えると、C-CPEが結合したクローディン-19ではこの掌がC-CPE側を向いており、C-CPEと相互作用をしている箇所は人差し指、中指、親指(β1、β2、β5)のみであるため、あたかも3本の指先でC-CPEを掴んでいるようにみえる。これまでにC-CPE感受性を決めていると考えられてきたβ5付近の細胞外領域はC-CPEとぴったりと接着しており、形状の相補関係からも特異的に結合を形成している。過去の報告ではβ1領域やβ2領域はC-CPEと相互作用しないとされていたが今回の構造解析ではβ1、β2領域もC-CPEと相互作用し結合していた。クローディン-19のアミノ酸残基に変異を導入したクローディン-19変異体を発現させ、蛍光ゲルクロマトグラフィーによって解析を行った。その結果でもC-CPEとの結合にはβ5付近の領域だけではなく、β2領域も重要であることが明らかになった。

また、C-CPE結合性であるクローディンサブタイプ間のアミノ酸配列の保存性とC-CPEとクローディン-19との結合に重要であった残基がほとんど一致していたことから、C-CPEとクローディンの結合様式はサブタイプ間でほとんど同じであると考えられた。

TJストランドの崩壊モデル編集

C-CPEが結合していないクローディン-15のストランド状の結晶構造とC-CPEが結合したクローディン-19の結晶構造を比較することでC-CPEの結合によるTJストランドの崩壊機構が考察できる。

ストランド形成に重要な細胞外領域の短いヘリックス(ECH)の構造が消失すること
掌モデルで親指に見立てたβ5を含むECS2領域の構造変化
結合したC-CPEが隣のクローディン分子とぶつかる

上記の3点によりクローディンの重合が阻害されてストランド形成ができなくなると考えられている。

関連画像編集

脚注編集

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  1. ^ Tsukita S, Furuse M, Itoh M.: Multifunctional strands in tight junctions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001 Apr;2(4):285-93. Review. PMID 11283726
  2. ^ Ruffer C, Gerke V.: The C-terminal cytoplasmic tail of claudins 1 and 5 but not its PDZ-binding motif is required for apical localization at epithelial and endothelial tight junctions. Eur J Cell Biol. 2004 May;83(4):135-44. PMID 15260435
  3. ^ Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, Furuse M, Tsukita S.: Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003 May 12;161(3):459-60. PMID 12743111
  4. ^ Simon DB, Lu Y, Choate KA, Velazquez H, Al-Sabban E, Praga M, Casari G, Bettinelli A, Colussi G, Rodriguez-Soriano J, McCredie D, Milford D, Sanjad S, Lifton RP. Paracellin-1, a renal tight junction protein required for paracellular Mg2+ resorption. Science. 1999 Jul 2;285(5424):103-6. PMID 10390358
  5. ^ Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S.: Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to occludin. J Cell Biol. 1998 Jun 29;141(7):1539-50 PMID 9647647
  6. ^ 『新 細胞接着分子の世界』(羊土社 2001年4月)
  7. ^ 『小さな小さなクローディン発見物語』(羊土社 2006年2月)
  8. ^ Science. 2014 Apr 18 344(6181) 304-7. PMID 24744376
  9. ^ 実験医学 Vol.32 No.14 2014 p2259-2262 ISBN 9784758101318
  10. ^ Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Dec 10;93(25):14532-5. PMID 8962086
  11. ^ J Biol Chem. 2011 Jun 3 286(22) 19549-55. PMID 21489981
  12. ^ Science. 2015 Feb 13 347(6223) 775-8. PMID 25678664
  13. ^ 臨床免疫・アレルギー科 Vol.64 No.3 2015 p299-306

外部リンク編集